การสอบปฏิบัติการและทักษะทางชีววิทยา
งานตอบปัญหาชีววิทยา "จุฬาฯ วิชาการ 2551"
ชิงโล่พระราชทานสมเด็จพระเทพรัตนราชสุดาฯ สยามบรมราชกุมารี
คำชี้แจง
1. ข้อสอบฉบับนี้เป็นข้อสอบปฏิบัติการและทำตอบข้อสอบจำนวน 6 ข้อ มีคะแนนเต็ม 40 คะแนน
2. ข้อสอบฉบับนี้มีทั้งหมด 4 หน้า (ไม่รวมปก)
3. การประเมินผลมี 3 ส่วน คือ
- การประเมินผลการทำปฏิบัติการโดยกรรมการผู้คุมสอบ
- การตรวจผลการย้อมสีแกรม
- การทำตอบข้อสอบ
4. มีเวลาในการสอบปฏิบัติการและทำตอบข้อสอบรวมทั้งหมด 1 ชั่วโมง
5. บริเวณที่นั่งสอบจะมีเสื้อกาวน์ ถุงมือ อุปกรณ์การสอบปฏิบัติการ และคำชี้แจงในการสอบปฏิบัติการวางไว้ให้ผู้เข้าสอบแต่ละคน
6. เมื่อกรรมการผู้คุมสอบให้สัญญาณเริ่มทำปฏิบัติการ โปรดตรวจสอบจำนวนหน้าของข้อสอบ หากมีปัญหาให้แจ้งกรรมผู้คุมสอบทันที แล้วให้ผู้เข้าสอบเขียนชื่อ-สกุล และเลขที่นั่งสอบ ลงบนหน้าแรก รวมทั้งอ่าน คำชี้แจงในการสอบปฏิบัติการให้เข้าใจ และเริ่มทำปฏิบัติการ
7. จะมีสัญญาณเตือนเมื่อเวลาผ่านไปแล้ว 45 นาที และเมื่อหมดเวลาสอบ
8. ไม่อนุญาตให้ผู้เข้าสอบออกจากห้องสอบก่อนเวลาผ่านไป 45 นาที
9. หากเวลาผ่านไป 45 นาทีแล้ว ถ้าผู้เข้าสอบต้องการส่งกระดาษคำตอบก่อนหมดเวลา ให้ยกมือเรียกกรรมการผู้คุมสอบเพื่อส่งกระดาษคำตอบ เมื่อกรรมการผู้คุมสอบเก็บกระดาษคำตอบแล้ว อนุญาตให้ผู้เข้าสอบออกจากห้องสอบได้
10. เมื่อหมดเวลาสอบปฏิบัติการ ให้ผู้เข้าสอบหยุดทำปฏิบัติการและนั่งประจำที่จนกว่ากรรมการผู้คุมสอบจะเก็บกระดาษคำตอบและประกาศให้ออกจากห้องสอบปฏิบัติการ
11. ให้ผู้เข้าสอบนำถุงมือทิ้งลงในถุงขยะสีแดง และถอดเสื้อกาวน์วางไว้ในที่ที่กำหนดไว้ และล้างมือให้สะอาดก่อนออกจากห้องสอบปฏิบัติการ
ชื่อ.....................................................................................เลขที่....................................
คู่มือการสอบภาคปฏิบัติการ
"การย้อมสีแกรม"
สารเคมีและอุปกรณ์
1. ขวดหยด บรรจุ Crystal violet
2. ขวดหยด บรรจุ Gram iodine
3. ขวดหยด บรรจุ 95% Ethanol
4. ขวดหยด บรรจุ Safranin O
5. ขวดบรรจุน้ำสำหรับล้าง 1 ขวด
6. จานเพาะเชื้อซึ่งมีเชื้อจุลชีพ A, B และ C
7. ถุงมือ 2 คู่
8. ตะเกียงบุนเซน
9. ดินสอเขียนแก้ว
10. กระดาษชำระ
11. เข็มเขี่ยเชื้อแบบห่วง (loop)
12. แท่งแก้ว (rack) สำหรับวางสไลด์ขณะย้อม
13. สไลด์ 3 แผ่น
14. ปากคีบพลาสติกสำหรับย้อมแกรม
15. กล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสง
16. ขวดหยด บรรจุ immersion oil
17. ถาดย้อม
18. กระดาษเช็ดเลนส์
หมายเหตุ : เชื้อจุลชีพ A, B และ C ซึ่งใช้ทดสอบในปฏิบัติการนี้เป็นเชื้อที่สามารถก่อโรคได้ (pathogen) ควรใส่ถุงมือและเสื้อกาวน์ทุกครั้ง และทำปฏิบัติการด้วยความระมัดระวัง
ขั้นตอนการทำปฏิบัติการ
การย้อม Gram stain เป็นที่นิยมสำหรับการศึกษาและการจำแนกชนิดของแบคทีเรีย เนื่องจากองค์ประกอบของผนังเซลล์ของแบคทีเรียบางชนิดมีความสามารถในการเก็บกักสี crystal violet ไว้ได้หลังจากการล้างด้วย decolorizer เช่น 95% ethanol จึงทำให้ติดสีม่วง แต่แบคทีเรียบางชนิดไม่มีคุณสมบัติดังกล่าวจึงทำให้ติดสีแดงของ Safranin O ซึ่งขั้นตอนในการย้อม Gram stain มีดังต่อไปนี้
1. การเตรียม smear
1) ใช้ดินสอเขียนแก้ว เขียนด้านหลังแผ่นสไลด์กำกับเชื้อที่จะทำ smear
2) เผาปลาย loop จนร้อนแดง แล้วทิ้งให้เย็น
3) ใช้ loop แตะน้ำขนาดประมาณเท่าเม็ดถั่วเหลือง มาแตะที่สไลด์
4) ใช้ loop เขี่ยเชื้อจากจานเพาะเชื้อด้วยวิธี aseptic technique ดังนี้
- จับปลายด้าม loop ลักษณะเช่นเดียวกับจับปากกาหลวมๆ
- เผาปลาย loop จนร้อนแดง แล้วทิ้งให้เย็น
- ใช้ loop เขี่ยโคโลนีเดี่ยวที่แยกออกมา (ควรเขี่ยเชื้อมาจากยอดโคโลนีเพียงเล็กน้อย เพื่อให้เห็นการจัดเรียงตัวอย่างชัดเจน ไม่หนาแน่นจนเกินไป) จากจานเพาะเชื้อ
- นำเชื้อที่เขี่ยได้มาผสมกับหยดน้ำบนแผ่นสไลด์และเกลี่ยจากตรงกลางวนออกเป็นวงกว้างให้มีความหนาพอสมควร
- เผาปลาย loop จนร้อนแดง แล้วทิ้งให้เย็น
5) ทิ้ง smear ให้แห้งในอากาศ (smear ที่ดีจะมีลักษณะเป็นฝ้าบางๆ)
2. การทำ heat fix
1) นำแผ่นสไลด์ด้านหลัง (ไม่ใช่ด้านที่ทำ smear) ผ่านเปลวไฟ 3-4 ครั้งอย่างรวดเร็ว
2) ทิ้งแผ่นสไลด์ให้เย็นแล้วจึงนำมาย้อมสีแกรม
3. การย้อมสีแกรม (gram stain)
1) วางแผ่นสไลด์ที่จะย้อมบนแท่งแก้วในถาดย้อม ให้ด้านที่ smear อยู่ด้านบน
2) หยดสี crystal violet ให้ท่วมบริเวณ smear ทิ้งไว้นาน 1 นาที
3) เทสี crystal violet จากแผ่นสไลด์ทิ้งลงในถาดย้อม ล้างแผ่นสไลด์ด้วยน้ำ
4) หยด gram iodine ให้ท่วมบริเวณ smear ทิ้งไว้นาน 1 นาที
5) เทสี gram iodine จากแผ่นสไลด์ทิ้งลงในถาดย้อม ล้างแผ่นสไลด์ด้วยน้ำ
6) ล้างสี (Decolorize) ด้วย 95% alcohol ใช้เวลาประมาณ 10-20 วินาที ขึ้นกับความหนาของ smear
***การย้อมสีจะถูกต้องหรือไม่อยู่ที่ขั้นตอนนี้เป็นสำคัญ อย่าล้างนานเกินไปจะทำให้สีติดผิดพลาด
7) เท 95% alcohol จากแผ่นสไลด์ทิ้งลงในถาดย้อม ล้างแผ่นสไลด์ด้วยน้ำ
8) หยดสี safranin O ให้ท่วมบริเวณ smear ทิ้งไว้นาน 30 วินาที
9) เทสี safranin O จากแผ่นสไลด์ทิ้งลงในถาดย้อม ล้างแผ่นสไลด์ด้วยน้ำ
10) คว่ำแผ่นสไลด์ด้านที่ smear บนกระดาษชำระ เพื่อซับน้ำให้แห้ง
***อย่าถูแผ่นสไลด์กับกระดาษชำระ เพราะจะทำให้เชื้อที่ smear ไว้หลุดออก
4. การตรวจดูจุลชีพจากสิ่งย้อม โดยใช้กล้องจุลทรรศน์
1) เริ่มต้นดูแผ่นสไลด์ด้วยเลนส์วัตถุที่มีกำลังขยายต่ำก่อน ปรับ coarse และ fine adjustment จนกระทั่งเห็นภาพชัดเจน
2) หยด oil immersion 1 หยด ลงบนแผ่นสไลด์
3) หมุนปรับเลนส์วัตถุเป็นเลนส์กำลังขยาย 100
"โดยหมุนไปในทิศทางที่ไม่ให้เลนส์กำลังขยาย 40 สัมผัสกับ oil"
"ห้ามปรับ coarse adjustment ขณะดูด้วยเลนส์กำลังขยาย 100 โดยเด็ดขาด"
4) หากผู้เข้าสอบพบเชื้อที่ย้อมไว้แล้วและพร้อมที่จะส่งผลการย้อมนั้น ให้ผู้เข้าสอบยกมือเรียกกรรมการผู้คุมสอบ (หากผู้เข้าสอบไม่ส่งผลการย้อมสีแกรม จะไม่ได้รับคะแนนในส่วนนี้)
5. การทำความสะอาดและเก็บอุปกรณ์
1) หลังจากใช้กล้องจุลทรรศน์เสร็จ ให้ทำความสะอาดเลนส์วัตถุกำลังขยาย 100 ด้วยกระดาษเช็ดเลนส์ และเก็บกล้องจุลทรรศน์ตามวิธีที่ถูกต้อง
2) ล้างและทำความสะอาดอุปกรณ์ย้อมสีแกรม แล้วเก็บให้เรียบร้อย
คำสั่ง จงเลือกคำตอบที่ถูกต้องที่สุดโดยทำเครื่องหมายกากบาท (´) ซึ่งตอบได้มากกว่า 1 คำตอบ
คะแนนรวม................
หรือเติมคำตอบในช่องว่างที่กำหนดให้ คะแนนรวมทั้งหมด 40 คะแนน
ข้อ 1
1.1 จากภาพที่เห็นภายใต้กล้องจุลทรรศน์ พบเซลล์จุลชีพ A มีลักษณะการติดสีอย่างไร (3 คะแนน)
* ติดสีม่วงของ Crystal violet * Gram negative stain
* ติดสีแดงของ Safranin O * Gram positive stain
1.2 รูปร่างของเซลล์จุลชีพ A ตรงกับข้อใดต่อไปนี้ (2 คะแนน)
* Streptococcus * Staphylobacillus * Streptobacillus * Spirochete * Staphylococcus * Short rod
1.3
โครงสร้าง X
Phospholipids
ภาพ ก
โครงสร้าง X Phospholipids
ภาพ ข
เซลล์จุลชีพ A มีผนังเซลล์ตามภาพใด (5 คะแนน)
* ภาพ ก * ภาพ ข * ไม่ตรงกับทั้งสองภาพ
1.4 ชีวโมเลกุลประเภทใดที่เป็นองค์ประกอบที่สำคัญของโครงสร้าง X (ภาพข้อ 1.3) (3 คะแนน)
ตอบ _________________________________________________________________
ข้อ 2
2.1 จากภาพที่เห็นภายใต้กล้องจุลทรรศน์ นักเรียนพบเซลล์จุลชีพ B มีลักษณะการติดสีอย่างไร (3 คะแนน)
* ติดสีม่วงของ Crystal violet * Gram negative stain
* ติดสีแดงของ Safranin O * Gram positive stain
2.2 รูปร่างของเซลล์จุลชีพ B ตรงกับข้อใดต่อไปนี้ (2 คะแนน)
* Streptococcus * Staphylobacillus * Streptobacillus * Spirochete * Staphylococcus * Short rod
2.3 เซลล์จุลชีพ B มีผนังเซลล์ตามภาพใด (5 คะแนน) ใช้ภาพเดียวกับข้อ 1.3
* ภาพ ก * ภาพ ข * ไม่ตรงกับทั้งสองภาพ
ข้อ 3
3.1 จากภาพที่เห็นภายใต้กล้องจุลทรรศน์ พบเซลล์จุลชีพ C มีลักษณะอย่างไร
(การติดสี, รูปร่าง, การเรียงตัว) จงวาดรูปพร้อมคำอธิบายประกอบ (4 คะแนน)
_______________________________________________ _______________________________________________ _______________________________________________ _______________________________________________
3.2 เซลล์จุลชีพ C มีผนังเซลล์ตามภาพใด (5 คะแนน) ใช้ภาพเดียวกับข้อ 1.3
* ภาพ ก * ภาพ ข * ไม่ตรงกับทั้งสองภาพ
ข้อ 4 จุลชีพใดมีการสร้างสปอร์เพื่อการสืบพันธุ์ (2 คะแนน)
* จุลชีพ A
* จุลชีพ B
* จุลชีพ C
ข้อ 5 จีโนม (genome) ของจุลชีพใดที่มีโครงสร้างเป็น circular (2 คะแนน)
* จุลชีพ A
* จุลชีพ B
* จุลชีพ C
ข้อ 6 การถอดรหัสพันธุกรรม (transcription) และการแปลรหัสเป็นสายโพลีเปปไทด์ (translation) ของยีนหนึ่งๆ จะเกิดควบคู่ไปพร้อม ๆ กัน (simultaneous) ในจุลชีพใด (4 คะแนน)
* จุลชีพ A
* จุลชีพ B
* จุลชีพ C
จบการสอบรอบปฏิบัติการ
เตรียมตัวสอบปฏิบัติการเวียนฐานต่อไป ในเวลา 10.00 – 12.00 น.
--
ไม่มีความคิดเห็น:
แสดงความคิดเห็น